METODE PEWARNAAN BAKTERI

METODE PEWARNAAN BAKTERI
Jenis-jenis pewarnaan kuman yang dikenal adalah:
1.    Pewarnaan negatif
2.    Pewarnaan sederhana
3.    Pewarnaan difrensial
4.    Pewarnaan khusus

1.PEWARNAAN NEGATIF
Pewarnaan ini dipakai untuk yang sukar di warnai, misalkan Spirochaeta (Treponema, Leptospira dan Borrelia)

2. PEWARNAAN SEDERHANA
Pewarnaan ini hanya menggunakan satu macam zat warna. Misalkan Biru metilen, Air Fukhsin atau Ungu Kristal selama 1-2 menit. Zat warna Anilin mudah di serap oleh kuman.

3. PEWARNAAN DIFFRENSIAL
Pewarnaan Diffrensial menggunakan lebih dari satu macam Zat warna:
A.    Pewarnaan Gram: Pewarnaan Diffrensial yang sangat penting. Ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.
B.    Pewarnaan Tahan Asam (acid fast staining). Misalkan pewarnaan Ziehl-Neelsen dan Kinyoun-Gabbett untuk membedakan kuman-kuman yang tahan Asam dari yang tidak Tahan Asam.

A.PEWARNAAN GRAM
Pewarnaan Differensial dimaksudkan untuk membedakan 2 jenis bakteri berdasarkan daya rekat dinding bakteri terhadap zat warna. Salah satu jenis pewarnaan differensial adalah Pewarnaan Gram, yang menggunakan 2 macam zat warna yaitu Zat warna Primer (Kristal Violet) dan Zat warna Sekunder (Fucshin atau Safranin).
Bakteri dapat membentuk bulat/kokus/coccus dengan susunan berkelompok atau berantai, sebagian besar bakteri ini bersifat Gram Positif. Bakteri berbentuk berbentuk batang/basil/bacil dapat bersusun satu-satu, berantai ataupun bertumpuk seperti kayu bakar, sebagian besar bersifat Gram negatif.
•    Cara Pewarnaan:
1.Sediaan yang sudah direkat diwarnai dengan karbol Kristal Ungu selama 5 menit.
2. Zat warna dibuang dan diganti dengan larutan Lugol dibiarkan selama 45-60 detik.
3. Larutan Lugol dibuang dan sediaan dicuci dengan Alkohol 96% selama 30 detik atau digoyang-goyangkan sampai tidak ada zat warna yang mengalir lagi.
4. Sediaan dicuci dengan air dan diwarnai dengan air Fukhsin selama 1-2 menit. Sediaan dicuci, dikeringkan dan diperiksa dibawah mikroskop.

Hasil dapat dibaca sebagai berikut:
-Kuman Positif Gram berwarna Ungu
- Kuman Negatiif Gram berwarna Merah
Sifat kuman terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu kuman.

B.PEWARNAAN  BAKTERI  TAHAN ASAM
Pewarnaan ini adalah segolongan bakteri yang sulit diwarnai, tetapi sekali  diwarnai sulit dihapus. Dinding  sel bakteri tahan asam terdiri dari peptidogikan, arabinogalaktan, dan lipid, dimana 50% dari lipid ini terdiri dari asam nikolat. Bakteri ini dimasukkan kedalam golongan mikrobacterium yang sebagian besar bersifat satprofit, dikenal juga golongan atipik , sebagian kecil pathogen bagi manusia yaitu Mycrobaterrium tuberculosis dan Mycrobacterium leprae. Dari pewarnaan BTA dapat dibedakan 2, yaitu  golongan bakteri tahan asam  yang akan tetap mengikat zat pewarnaan primer (karbofuksin) dan tidak akan dilepas pada pencucian alkoholm asam, serta tidak akan mengikat zat warna sekunder ( metilen blue), sedangkan bakteri tidak  tahan asam akan melepaskan zat warna  primer pada pencucian alcohol asam  dan akan mengikat zat warna  sekunder.
Ada beberapa  cara  mewarnai bakteri tahan asam yaitu, menurut Ziehl-Neelseen, menurut Tan Thiam Hok (1957) yang disebut juga pewarnaan Kinyoun Gabelt, serta pewarnaan dengan AURAMEN-PHENOL FLUORCHROME.
•    Cara Pewarnaan:
1.    Metode  ZIEHL-NEESEN
a.    Buat sediaan dari sputum dengan cara, bersihkan kaca benda  hingga bebas dari lemak, bakar ose hingga pijar dan tunggu dingin sejenak, ambil sputum dengan ose kemudian oleskan diatas kaca benda hingga didapat usapan yang rata dan tipis, tunggu dan keringkan dan difiksasi diatas api. Ose setelah digunakan dibakar lagi hingga pajar.
b.    Tuangi sediaan dengan karbol fuksin hingga tergenang, kemudian panaskan  diatas api  kecil sampai keluar asap lalu tunggu selama 5 menit
c.    Cuci dengan air mengalir
d.    Celupkan kedalam H2SO4 selama 2 detik untuk kuman M. leprae
e.    Celukan kedalam alcohol  60% sehingga tidak ada lagi zat warna merah yang larut
f.    Tuangi preparat dengan methylen blue selama 1-2 menit
g.    Cuci dengan air mengalir keringkan tetesi minyal imaersi dan amati dengan mikroskop pembesaran 10 X 100

2.    Metode  KINYOUN – GABBET
a.    Buat sediaan sputum dan rekatkan
b.    Sediaan dituangi larutan Kinyoun dan dibiarkan selama 3 menit
c.    Dicuci dengan air mengalir
d.    Preparat dituangi larutan Gabbet dan dibiarkan selama 1 menit
e.    Cuci dengan air mengalir  lalu amati dengan mikroskop dengan pembesaran 10 X 100

Hasil dapat dibaca sebagai berikut:
1.    Bakteri bersifat tahan asam akan berwarna Merah
2.    Bakteri  bersifat tidak tahan asam berwarna Biru

4.PEWARNAAN  KHUSUS
A.    PEWARNAAN  KAPSUL BAKTERI
Kegunaan kapsul bakteri :
1.    Mencegah kekeringan pada kondisi yang tidak menguntungkan
2.    Meningkatkan kemampuan bakteri untuk menimbulkan  penyakit, merupakan lapisan pelindung yang menghalangi proses fagositosis oleh sel daraah putih.
Beberapa metode pewarnaan kapsul :
1.    Pewarnaan Muir; kapsul bewarna biru dan badan bakteri berwarna merah.
2.    Pewarnaan Hiss; kapsul berwarna biru muda dan badan bakteri ungu tua.
3.    Pewarnaan Gins-Burri kombinasi pewarnaan negative dan sederhana, akan didapat hasil kapsul tidak berwarna dan badan bakteri berwarna merah, karena kapsul mudah ditembus zat warna tetapi sukar mengikat zat warna.

•    Cara Pewarnaan:
1.Buatlah sediaan Bakteri pada salah satu ujung kaca benda
2. Teteskan satu tetes Tinta Cina disebelah suspense kuman
3. Campurkan kedua suspensi tadi dengan menggunakan ujung kaca benda lain, kemudian dengan kaca benda tersebut ratakan suspensi kuman sepanjang kaca benda.
4. Keringkan sediaan dan direkatkan
5. Genangi dengan larutan karbol Fukhsin selama 2 menit
6. Cuci dengan air mengalir perlahan-perlahan dan keringkan diudara.
7. Amati dengan Mikroskop pembesaran 10 x 100, pada bagian yang tipis
Keterangan:
-    Langkah 1-4 : Metoda Pewarnaan negative (Burri)
-    Langkah 5-7 : Metoda Pewarnaan Gins

Hasil dapat dibaca sebagai berikut:
-    Kapsul bakteri : Tidak Berwarna
-    Badan bakteri Asam : akan berwarna Merah
-    Latar belakang : Hitam

B.    PEWARNAAN SPORA BAKTERI
Beberapa genus bakteri dapat membuat endospora, yang diantaranya adalah dari genus bacillus dan clostridium. Bakteri ini mengalami siklus diverensiasi untuk merespon keaddaan lingkungan buruk seperti : kekeringan, kekurangan makanan, dll. Tiap sel membentuk satu endospora yang akan dilepaskan bila sel induk  mengalami otolisis. Spora adalah bagian dalam bentuk istirahat. Spora bersifat resisten terhadap panas, kekeringan , dan zat kimiawi. Bila kondisi lingkungan telah baik kembali spora dapat kembali melakukan gemisasi dan memproduksi sel vegetative.
•    Cara Pewarnaan:
1.    Buat suspensi bakteri didalam 1 ml NaCl 0,9% hingga keruh seperti susu
2.    Masukkan karbol Fuchsin ke dalam suspensi bakteri tadi sama banyak (1:1)
3.    Homogenkan, panaskan dengan api kecil (70%) selama 6 menit jaga jangan sampai mendidih
4.    Siapkan kaca benda yang telah bersih
5.    Buat preparat dari suspense tadi rekatkan dan dinginkan
6.    Celupkan kedalam bejana yang berisi larutan H2SO4 1% selama 2-3 detik
7.    Cuci dengan air mengalir perlahan-lahan
8.    Genangi dengan Metilen Blue selama 2-4 menit
9.    Cuci dengan air mengalir perlahan-lahan, dan keringkan
10.    Amati dengan Mikroskop pembesaran 10 x 100

Hasil dapat dibaca sebagai berikut:
-    Spora bakteri : Merah
-    Badan bakteri asam : akan berwarna Biru


C.PEWARNAAN FLAGEL
o    Flagel merupakan komponen tambahan  dari sel yang menyerupai benang, terdiri dari protein Flagelin
o    Dikenal 4 jenis flagel :
    Monotrikh, flagel tunggal pada salah satu ujung, missal :  Vibrio sp.
    Lofotrikh, terdapat 1/lebih flagel disalah satu ujung , Alcalingenes  sp
    Amfitrikh, terdapat 1/lebih flagel di kedua ujung, cth:  Alcalingenes sp
    Peritrikh, flagel terbesar diseluruh badan kuman, cth: Pruteus vulganis
Flagel merupakan organel sel yang tidak dapat dilihat dengan pewarnaan biasa. Ntuk itu pewarnaan khusus atau dengan mikroskop electron. Salah satu pewarnaan yang digunakan untuk melihat flagel adalah pewarnaan Gray serta beberapa pewarnaan lain diantaranya pewarnaan Novel, Zattnow, dan Fontana-Tribondeau dengan menggunakan impregnasi Ag.

Pewarnaan Gray
Digunakan untuk  pemantek / mordant untuk mneingkatkan afinitas flagel terhadap zat warna dan memperbesar  diameter flagel. Zat warna yang digunakan adalah Karbol Fuksin menjadi flagel dan badan kuman berwarna merah.
Gerak Bakteri
Gerak bakteri dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara langsung dan secara biakan. Biakan yang digunakan tidak mengandung gula karena adanya gula dapat meurunkan pH media sehingga gerak bakteri akan terhambat. Biakan yang digunakan harus mempunyai konsisten setengah padat agar bakteri dapat bergerak bebas. Biakan bakteri yang akan diperiksa harus  lebih  dari  20 jam dan perlu diperhatikan bahwa suhu optimum untuk gerak bakteri dibawah 300 C.

•    Cara Pewarnaan:
1.    Metode Tetes Tegak
a.    Kaca benda dibersihkan agar terbebas dari lemak
b.    Disiapkan gelas penutup dengan memberikan vaksin pada keempat sisinya
c.    Letakkan suspense bakteri pada bagian tengah kaca benda jangan ditipiskan
d.    Tutup suspense tersebut dengan kaca penutup
e.    Amati dengan mikroskop pembesaran 10 X 100

2.    Metode Tetes Gantung
a.    Kaca benda cekung dibersihkan agar terbebas dari lemak
b.    Disiapkan kaca penutup dengan memberikan vaselin pada keempat sisinya
c.    Letakan suspensi kuman dibagian tengah kaca penutup, JANGAN DITIPISKAN
d.    Peganglah kaca benda cekung dengan bagian cekung menghadap kebawah, kemudian dekatkan kaca benda ini perlahan-lahan pada kaca penutup sedemikian rupa sehingga bagian cekung melingkupi suspensi bakteri. Tekan perlahan-lahan agar vaselin menyebar
e.    Dengan hati-hati namun cepat baliklah kaca benda tersebut, kemudian amati dengan mikroskop pembesaran 10x kemudian 40x

Hasil dapat dibaca sebagai berikut:
-    Gerak Positif: Bila bakteri berpindah tempat dengan cepat
-    Gerak Negatif: Bila bakteri bergerak ditempat saja akibat gerakan molekul air (Gerak Brown)

3.      Biakan Semi Solid
a.    Disiapkan media semi solid SIM atau MIO
b.    Ambil biakan bakteri dengan menggunakan ose jarum yang sebelumnya telah dipijarkan
c.    Tusuk ose tersebut pada bagian tengah media hinnga dasar
d.    Eramkan media tersebut dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37 C

Hasil dapat dibaca sebagai berikut:
-    Gerak Positif: Bila bakteri tumbuh menyebar akan terlihat kekeruhan atau turbiditas
-    Gerak Negatif: Bila bakteri hanya tumbuh pada bekas tusukan.
(Sumber :
Tim Dosen Mikrobiologi Lingkungan Politeknik Kementerian Kesehatan Jakarta II jurusan Kesehatan Lingkungan, Dra. Syarifah Miftahul El Jannah T . M. Biomed; Modul Praktikum Mikrobiologi Lingkungan, Jakarta.)